基因克隆正反引物长度必须一样吗

上下引物的Tm最好相似,不能差异太大,不然不好设计退火温度；内参条带很亮,说明RT应该没多大问题,问题可能出现在PCR上.没有目的基因是因为1该基因确实不表达；2你的引物不特意,到NCBI的Prime

能,有啥不能的啊,一切皆有可能嘛,

你这是mRNA序列还是cDNA序列啊?你目的是什么?引物你设计在什么位置,你还是说清楚点吧!再问：要做的是基因的表达，这个基因是从NCBI上直接查询得到的。http://www.ncbi.nlm.ni

你看,你分别获得了1-1200nt以及1000-1400nt这两段序列,那么中间有200bp长度的序列是重叠的,对吧?也就是说你已经从序列信息上获得了这个CD区所有的序列信息.如果你只是需要序列信息的

构建载体需要酶切的,所以需要加接头的!

首先要知道这段基因的序列,然后可以用软件来设计,如Primer我就知道这个,看到别人用,很好推荐

你的pcr产物不就是你的目的EST序列咩?你设计的引物就是为了把目的EST序列扩增出来啊

我觉得不是,所谓的克隆应该是指遗传物质的克隆,而遗传物质并不紧紧指DNA,它还涉及RNA和蛋白质（蛋白质是阮病毒的遗传物质）,所以我想并不是指DNA的克隆.

可以用,没有任何特别问题.实际上,如果你用过一些引物设计的软件,有时候你会发现,软件设计出来的引物长度有可能不同（当然,大部分时候是相同的）,这有可能是考虑的引物Tm,引物二聚体,引物非特异性结合等问

可能是模板结构问题,多试几种PCR试剂,个人觉得Takara的LA扩增能力比较强

这一步骤是将目的DNA片段构建到某载体（质粒）上,并转化大肠杆菌保存.当然最有可能的就是基因克隆.引物可以理解为PCR的指针,确定需要扩增的片段,通过PCR即可扩增出正反向引物之间的DNA片段.

普通PCR是基因克隆的基础,原理一致.基因克隆在于所扩的序列是未知的,现在很多生物的全基因序列已经公布,多重序列比较设计简并引物,克隆出保守区域的片段,在通过RACE等方法把上下游的序列扩出来.

和从哪设计引物没关系如果编码区有突变的话那就肯定不行的最简单的就是拿去测序CDS区完全正确就可以了验证功能的话就做western以及检测该基因下游targets的表达量比如它可以促进A的表达就转染细胞

如果是少量序列需要克隆再行一代测序,如果有大量序列可直接扩增行二代测序.

我有一个关于primer5的使用技巧的文档,你需要的话可以给你,里面介绍很详细,其实引物设计都是很简单的,自己多试试就很简单了

建议你先上网学习一下引物设计最简单的一些知识我设计引物是用Omiga软件的,使用比较简单,只要新建一个核酸文件,把目的基因序列粘贴进去,扩增全长的话一般都是手工选取18～22bp长度,再加入内切酶碱基

那是显然的,所以在提rna做pcr的时候,如果里面混了基因组dna,那就有可能导致假阳性再问：谢谢，但是这不是我想要的答案。请问做半定量RT-PCR的引物怎么设计？可以设计在基因的非翻译区，然后扩非翻

目的基因是动物的相关基因片段PCR扩增的吗?你采用mRNA还是DNA啊?是扩增16SrDNA?不然怎么会显示杆菌的片段?BLAST比对如此奇怪?应该不会插入错误16组,估计实验操作的问题,或者使用NC

引物长度不重要.其实,最重要的是引物与目标序列完全匹配就可以了.明显的发夹结构及引物自身和引物相互间的连接键能要注意一下,其他都没有什么.多试试,楼主一定能成功的.以下是我认为比较重要的地方,1、引物

“同一对引物可以扩增出不同基因；不同引物也可以扩增出相同基因?”“在基因诊断时,比如镰状细胞贫血是点突变,患者和正常人在突变点两侧的基因是一样的”　　这里混淆了基因和基因序列的概念.患者和正常人的基因