如何确定PCR反应中的退火温度和延长时间

58C,如果是有模板的话,58C或再低一些都可以,其实退火温度不需要刻意去要求,一般的PCR,52-60C就可以全解决.

这篇文章有详细描述：http://www.springerlink.com/content/h083177466217382/引物OY1(AATAACTTTTCGAATCGCAT)OY2(AAGACT

退火温度是影响PCR反应特异性的重要因素.引物与模板复性所需要的退火温度取决于引物的长度、碱基组成及其浓度.引物长度越短,引物中G+C的含量越低,所需的退火温度越低.虽然降低退火温度可能增加扩增产量,

退火温度基本和引物有关,如果产物特异性不好,可以适当提高退火温度.循环次数是你自己定的,如果模板量低（产物量少）就多循环几圈,不过最好别超过35个,里边的成分都耗损的差不多了.再循环也没大用了.

计算退火温度的方法：1.退火温度＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）－（5～8）只是粗算,有时不灵,但比较简便.2.用primer5（oroligo6）计算,引物配对好后,primer5可以显示Tm,我认

分别摸索实验条件测定,根据DNA电泳判断不过其实在做PCR的时候,根据合成的引物中的GC含量可以用公式计算出退火温度,一般比GC计算出的公式低5度比较合适

是反转录PCR么?如果是realtime的话应该可以确定是否到平台期吧?以参考文献来回答也是可以的.关键你要明白对方为什么问这件事.如果没有任何迹象表明你的实验结果不能很好支持你的结论的话,是不应该吸

你做个退火温度的梯度吧!大部分的PCR都有这一功能!退火温度选择一个范围,如50-60度,PCR仪器在一排（12个孔）或一列（8个孔）中每个孔的温度都不同,你在相应的孔中放入待反应的PCR混合液（保证

通常来说,退火温度是由引物的GC%含量决定的,但是反应体系的条件改变也会影响引物的退火温度（如Mg,Na等离子浓度）.建议你去http://www.idtdna.com/analyzer/Applic

唉,这种题就是中国特色,完全理论脱离实际.\x0dPCR退火温度是一个范围,一般是50度到65度,或者到70度做两步法PCR.其中,模板的GC含量、模板的组成（单一模板还是cDNA还是全基因组DNA还

可尝试45-70度设个梯度退火,P一次就知道哪个温度最适合.如没有梯度退火的PCR仪,则可试试两个Tm值中间的温度,一般较多在50、55度可P出来.你试试吧.

根据各试剂的终浓度来确定自己添加量,至于究竟应该用多大的体系我认为要根据自己的情况来确定,常用的有20,25,50等体系.建议参考别人的文献,一般做基因克隆的文章都会写反应体系,每种试剂用量.

TM值是在一定buffer盐浓度情况下计算出来的.你需要查一下你的PCR体系里buffer盐的浓度,然后找相应的TM值.不过TM值也是一个估算值,举个例子,以你的正向引物而说,TTACAAGATGGA

软件终归是软件,一个PCR体系的具体反应条件不通过实际运行是无法得知最佳退火温度的.建议你做一个梯度PCR摸索一下最佳退火温度.

1、软件预算2、利用梯度PCR优化退火温度

博凌科为-为你上下游温度很接近啊,45度,上下5度,0.2每个梯度.或者直接用47度P

一般用55°,不行的话用58°,再不行的话就设置从58-55的touchdown

说影响得看情况,退火温度太高肯定会影响引物的结合效率的.但是,实际上,好的引物一般是上下游引物的退火温度比较接近.有时候,我们可能会通过牺牲特异性的手段（当GC含量过高时,减少引物长度）来平衡两条引物

这个比较简单,其实你买Taq中就有反应体系,其实这个体系都是公司的人大量实验做出来的,我们实验室现在用Takra的Taq酶,体系就按说明书加的,不过体系是50ul的,我们把所有都减半做了25ul体系就

计算退火温度的方法：1.退火温度＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）－（5～8）只是粗算,有时不灵,但比较简便.2.用primer5（oroligo6）计算,引物配对好后,primer5可以显示Tm,我认