在提取的RNA中加入DNase后如何灭活DNase
来源:学生作业帮 编辑:作业帮 分类:生物作业 时间:2024/07/05 10:10:27
在提取的RNA中加入DNase后如何灭活DNase
一般两种办法,首先是每50ul体系中加入2ul 0.5M的EDTA然后80度水浴2分钟.另外一种是将50ul体系稀释到100ul然后加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混匀后12000rpm室温离心5min转上清,然后再加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),混匀后12000rpm室温离心5min,转上清.在上清中加入10ul 3M的醋酸钠和250ul冷乙醇,-70度放置20min.4度12000rpm离心10min,弃上清.70%冷乙醇洗涤1次,然后干燥.最后沉淀用RNase free 的水溶解.个人建议用第一种方法,第二种方法太耗时间而且RNA回收率也低.
再问: 但我看到有用0.05M的EDTA的?还有EDTA怎么容易溶解呢?
再答: 我这边一直用0.5M的EDTA,效果不错。0.05M的我没有试过不清楚。另外关于EDTA的溶解,EDTA的溶解度是随着pH的变化而变化的,在pH8的时候溶解度最高,恰好可以达到0.5M。所以配置EDTA的时候需要先调pH再定容。
再问: 那得用NaoH调PH,那样的话不就会成为含Na的EDTA了吗? 还有就是你怎么检测EDTA对于DNase灭活的效果呢?
再答: 首先市售的EDTA都是钠盐,也就是说一般都是EDTA-二钠或者EDTA-四钠,所以你用NaOH调pH一点影响都没有。然后EDTA在这里并不是灭活DNase的,而是螯合溶液中的二价镁离子和钙离子。DNase要有活性必须有镁离子辅助的,所以当体系中的镁离子被EDTA螯合后,DNase是没有多少活性的。然后,实际上对于DNase灭活的主要程序是80度水浴2分钟使DNase变性失去活性。大部分分子生物学操作的酶都是通过高温来灭活的,如内切酶和反转酶等。如果你一定要看检测效果的话,配一管没有加RNA的空体系,然后进行灭活处理,然后在体系中加入1ug的λ-DNA,消化大概24小时左右,然后去电泳,看看电泳条带有没有变化。这个是酶活检测标准,如果你时间多你可以去试试。
再问: 但我看到有用0.05M的EDTA的?还有EDTA怎么容易溶解呢?
再答: 我这边一直用0.5M的EDTA,效果不错。0.05M的我没有试过不清楚。另外关于EDTA的溶解,EDTA的溶解度是随着pH的变化而变化的,在pH8的时候溶解度最高,恰好可以达到0.5M。所以配置EDTA的时候需要先调pH再定容。
再问: 那得用NaoH调PH,那样的话不就会成为含Na的EDTA了吗? 还有就是你怎么检测EDTA对于DNase灭活的效果呢?
再答: 首先市售的EDTA都是钠盐,也就是说一般都是EDTA-二钠或者EDTA-四钠,所以你用NaOH调pH一点影响都没有。然后EDTA在这里并不是灭活DNase的,而是螯合溶液中的二价镁离子和钙离子。DNase要有活性必须有镁离子辅助的,所以当体系中的镁离子被EDTA螯合后,DNase是没有多少活性的。然后,实际上对于DNase灭活的主要程序是80度水浴2分钟使DNase变性失去活性。大部分分子生物学操作的酶都是通过高温来灭活的,如内切酶和反转酶等。如果你一定要看检测效果的话,配一管没有加RNA的空体系,然后进行灭活处理,然后在体系中加入1ug的λ-DNA,消化大概24小时左右,然后去电泳,看看电泳条带有没有变化。这个是酶活检测标准,如果你时间多你可以去试试。
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