DNA的电泳技术是怎么一回事

DNA的电泳技术是怎么一回事

凝胶电泳是一大类技术,被科学工作者用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子.凝胶电泳通常用于分析用途,但也可以作为制备技术,在采用某些方法（如质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)、克隆技术、DNA测序或者免疫印迹）检测之前部分提纯分子.该技术操作简便快速,可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段.当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide,EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置.此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆技术操作.
琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度.琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段.琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳.聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开.聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难.聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳.目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳.
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度.在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:
1、 DNA的分子大小:
线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢.
2、 琼脂糖浓度
一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同.DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系.凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小.分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%.
3、 DNA分子的构象
DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关.相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢.如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA.
4、 电源电压
在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比.但是随着电场强度的增加,不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小.要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm.
5、嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％.
6、 离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率.在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性.
对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温.