如何用光敏生物素标记质粒?
来源:学生作业帮 编辑:作业帮 分类:生物作业 时间:2024/09/02 00:34:32
如何用光敏生物素标记质粒?
要求有步骤,注意事项,
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生物素化质粒ds-DNA:将含质粒pBR332的大肠杆菌在含氨苄青霉素的LB培养基中扩增,取纯培养物用MagicTM DNA纯化系统,按Promega公司所附操作说明书提取质粒ds-DNA.取纯化的不含单链DNA的大肠杆菌质粒ds-DNA直接与长臂光敏生物素混合,用光标记灯进行光照标记,以制备生物素化质粒ds-DNA.可参考以下步骤:在一灭菌EP管中加待标记DNA 5ug/10uL,在暗室中加入5ug/uL光敏生物素,充分混匀,置冰浴中.
在特制光源下10cm处照射20min.加入100mmol/LTris-HCl,pH9.0(含0.1mmol/LEDTA)10uL,混匀.再加入等体积仲丁醇,混匀.离心lmin(10 000r/rain),吸去上层仲丁醇,弃去.再加入仲丁醇25uL,重复提取游离的光敏生物素.吸去上层无色仲丁醇后,加入5uL3mol/L醋酸钠,充分混匀,加入冷无水酒精100gL充分混匀,沉淀标记的DNA,置-20℃过夜(或-70℃l5min),15 000r/min离心20min,沉淀物再用70%乙醇洗1次,离心,抽干,溶于0.1mmol/LEDTA或TK中,测定探针浓度,分装,保存于-20℃.
在特制光源下10cm处照射20min.加入100mmol/LTris-HCl,pH9.0(含0.1mmol/LEDTA)10uL,混匀.再加入等体积仲丁醇,混匀.离心lmin(10 000r/rain),吸去上层仲丁醇,弃去.再加入仲丁醇25uL,重复提取游离的光敏生物素.吸去上层无色仲丁醇后,加入5uL3mol/L醋酸钠,充分混匀,加入冷无水酒精100gL充分混匀,沉淀标记的DNA,置-20℃过夜(或-70℃l5min),15 000r/min离心20min,沉淀物再用70%乙醇洗1次,离心,抽干,溶于0.1mmol/LEDTA或TK中,测定探针浓度,分装,保存于-20℃.
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