overlap 一、用这对引物A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttgA2

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：生物作业时间：2024/10/07 03:06:41

overlap
一、用这对引物
A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttg
A2- R：gatgacctcctcgcccttgctcaccatggtgcgcgcattggggcgccgggaag
扩增出片段A,产物长2540bp左右[color=Red]
已割胶回收,即片段A
二、用这对引物
B1- F：tcttcccggcgccccaatgcgcgcaccatggtgagcaagggcgaggaggtcatc
B2- R：cggatatccgatacattgatgagtttggacaaaccac
扩增出B片段,产物长1680bp
已割胶回收,即片段B
三、把一、二步中得到的PCR产物A、B通过overlap PCR连接起来,产物长4200bp左右
使用引物：
A1-F：gggggcccccaggctgacttaccagtccgccacctttg
B2- R：cggatatccgatacattgatgagtttggacaaaccac
就在这一步问题出现了,就是这步做了N多次,就是PCR不出目标条带,（每一次pcr产物都会出两个杂带很亮大约一个1100bp,一个1800bp,始终无目标带）
本人使用primestar酶采用温度梯度(50度至65度)、模板1:1浓度梯度（20ng至200ng）、同时也采用了两步法（68度5分钟或者72度5分钟退火延伸）.也使用过LATAQ酶 PfuUltra IIFusion HS DNA Polymerase 酶.都没扩增出目标条带.
也采用过体系中仅仅不加引物直接跑PCR20个循环,在加入引物在跑30个循环（也这样做过,取该体系中混合液2微升做模板,在重新做一次该PCR）结果还是没有目标条带.
以上PCR全是延伸5分钟,终延伸10分钟.具体的PCR都是按照酶的说明书操作.
本人可以说在实验过程中可以完全不用考虑因实验操作导致失败---这点可以肯定无误!

亲,仔细看一下,你的B1-F的5‘端是不是多了一个t,或者A2- R的3‘端少了一个A?这两个引物不是完美overlap唉

谁可以简单罗列下做OVERLAP PCR的要点吗?最好图解原理以及引物设计时候注意事项引物设计,用PRIMER 5 设计引物时,有的mRNA设计出来的引物序列,即使最高分的那对,也有二聚体或交叉, 我在做overlap PCR,两个片段一条736bp,一条255bp,20个重叠碱基,四个引物的TM值都是59度,两条都 PCR产物测序问题.我用简并引物扩增未知基因.设计了几对引物.都出现了目的条带.发现其中两对引物的产物长度比较长.因为我简并引物设计软件有Fasta格式的比对文件想设计简并引物该用什么软件? 这是引物二聚体吗? 英语翻译这句话翻译成中文谁会 the past and the future gently overlap ,origi 为什么用ENVI做正射校正的时候会出现image and dem do not have overlap look for overlap 关于引物设计要对目的基因进行定量分析,基因全长1932NT,是不是只要选择其中的一段就行了,长约400NT左右,那么这一引物的设计 PCR扩增连接转化这一系列是什么的步骤基因克隆吗?那引物是干嘛用的 PCR试剂盒600次,790元,某组织样品用15对随机引物扩增,就是15次PCR?有10个样品同时用同样的15对引物,是