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PCR过程中引物的碱基数量与种类 和 退火温度有什么关系?

来源：学生作业帮 编辑：作业帮 分类：生物作业 时间：2024/07/01 12:03:30
PCR过程中引物的碱基数量与种类 和 退火温度有什么关系?
理由
引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）.这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定 PCR退火温度是必需的.在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合.合理的退火温度从55℃ 到70℃.退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃.
设定Tm有几种公式.有的是来源于高盐溶液中的杂交,适用于小于18碱基的引物.
有的是根据GC含量估算Tm.确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法.这种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性.大部分计算机程序使用近邻分析法.
根据所使用的公式及引物序列的不同,Tm会差异很大.因为大部分公式提供一个估算的Tm值,所有退火温度只是一个起始点.可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性.开始低于估算的Tm5℃,以2℃为增量,逐步提高退火温度.较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成.
为获得最佳结果,两个引物应具有近似的Tm值.引物对的Tm差异如果超过5℃,就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始.如果两个引物Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃
或者为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环.这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝.
GC含量对这些温度的计算有影响是因为碱基对之间的结合有两种,GC对之间有三个氢键,AT对之间有两个氢键,所以打开这些碱基对所需的能量不一样.GC含量和AT含量是总和固定为1的所以知道其中一个就可以了.
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