黄颡鱼肿瘤坏死因子的基因兼并引物怎么设计啊?急.

黄颡鱼肿瘤坏死因子的基因兼并引物怎么设计啊?急.
我想克隆黄颡鱼的肿瘤坏死基因,但查不到基因序列,怎么设计兼并引物!
请高手多多指教!

找与此物种亲缘关系比较近的物种,将它们的核苷酸序列找出来,然后比对寻找高度同源的区域,引物就设在同源的位置
　　简并引物是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物.主要用来同源克隆未知的基因,或用来分析某一种基因多态性的一种方法.简并引物设计的常见程序如下：1.利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列.
　　因为密码子的关系,不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的,所以氨基酸序列才是真正保守的.首先利用NCBI的Entrez检索系统,查找到一条相关序列即可.随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白),在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列.
　　2.对所找到的序列进行多序列比对.
　　将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对,最好采用局部比对程序如BLOCK,网址：http://bioinformatics.weizmann.a ...ww/make_blocks.html.也可选工具有Clustal W.
　　3.确定合适的保守区域.
　　设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域,且两个保守区域相距50～400个氨基酸为宜,使得pcr产物在150~1200bp之间,最重要的是每一个保守区域至少有4个氨基酸.若比对结果保守性不是很强很可能找不到4个氨基酸的保守区域,这时可以根据物种的亲缘关系,选择亲缘相近的物种进行二次比对,若保守性仍达不到要求,则需进行三次比对.总之,究竟要选多少序列来比对,要根据前一次比对的结果反复调整.最终目的就是至少有两个4个氨基酸且两者间距离合适的保守区域.
　　4.利用软件设计引物.
　　在这里我们特别值得说明的是CODEHOP方法,该方法要求的保守区较短,而且能有效的降低引物的兼并度,是一种非常有效的方法.该方法主要是通过将简并区放在3′末端,并在5′端设计一个一致性的区域来降低兼并度,详见http://www.helixnet.cn/thread-8194-1-1.html.
　　5.对引物的修饰
　　若得到的引物为：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3,则其简并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304,很明显该条引物的简并度太高不利于 pcr.我们可以通过用次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度（有个查密码子偏好的数据库网址：http://www.helixnet.cn/viewthrea ...ht=%C3%DC%C2%EB%D7% D3）.
　　注意：该方法设计出来简并引物对,适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种.
　　引物中符号说明：
　　A代表A
　　C 代表C
　　G代表 G
　　T 代表T
　　M 代表A or C
　　R 代表A or G
　　W代表 A or T
　　S代表 C or G
　　Y代表 C or T
　　K代表 G or T
　　V 代表A or C or G
　　H 代表A or C or T
　　D代表 A or G or T
　　B 代表C or G or T
　　N代表 G or A or T or C