单酶切问题单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2u

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：综合作业时间：2024/10/01 11:15:56

单酶切问题
单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2ul,质粒8ul,buffer 4ul,结果仍是两条带,在5000bp左右,很相近.究竟什么问题,期待高人指点,酶用的是TAKALA的Ssp1.
顺便想问酶切后的质粒要与目的片段连接,是否需要进行胶回收纯化呢.查有篇文献构建该质粒时并没提到胶回收纯化,新手很多问题都不大懂,感谢大家关注

首先明确一个问题,你的这个酶切位点在这个质粒中是唯一的吗,也就是说你只想把这个质粒切开吗?看你的结果好象这种可能性大些,那样我觉得最有可能是梅切不完全,即切开的线形质粒会比未切开的质粒跑得慢但两条带很相近.
建议：首先电泳时要有原质粒作对照,这样你就可以确定跑得快的带是不是未完全切开的质粒了.其次想酶切完全,可延长梅切时间,看你的体系酶的量足够了,而且酶的量本身也不应大于1/10；只是不知梅切的时间.最后若是可以确定两条带中有一条是切开的,则可以利用胶回收纯化的方法得到所需的这一载体,在和目的片段连接,注意这时凝胶回收是必要的,但若两条带太相近,则可能切的时候难分离；若是改变实验条件最终完全梅切（只一条带,且和原质粒位置有差异）,则可以用加热65度20分钟的（对于37度酶）方法将酶灭活直接用作连接载体即可,不用回收.
以上是假设你的载体这个酶切位点唯一的情况,若不是则会切下一小段片段,并且一定要凝胶回收才可得到连接载体.

单酶切问题单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2u PCR产物的酶切问题PCR产物进行taqI内切酶酶切鉴定结果出现了几条杂带分析原因可能为条带内切不完全导致昨晚酶切如果质粒dna双酶切电泳后,在胶上出现1）没有条带2）一条3）两条4）三条5）多条,都是什么原因? 核酸电泳两条蓝色条带核酸电泳肉眼下观察到两条蓝色条带分别是什么东西,分别对应多大bp的marker? 想知道在做PCR电泳时加loading buffer 的作用是什么?多点少点有没有影响 ,我的体系是20ul,我加2ul 如果质粒DNA(假定提取的质粒DNA只有超螺旋一种结构)酶切电泳后,在琼脂糖凝胶上若出现以下情况,是什么原因用快速试剂盒提取土壤DNA 效果还好.PCR扩增后 marker很好,就是其他没条带,用的50ul的Taq酶体系p的,请 PCR产物问题如图~第一张是taq酶跑出来的条带~有产物,大小780bp~marker是DL2000而第二次是高保真酶跑看家基因GAPDH作为引物进行PCR,电泳检测有两条带,杂带大致出现在400bp,请问是咋回事! pcr电泳出现模糊团状条带是什么原因造成的我提取的DNA电泳后,条带很暗,而自外检测OD值在正常范围内,上样量为2ul,请问为什么基因工程中检测筛选含有目的基因的重组质粒是一个重要的步骤.现运用_酶切质粒,完全酶切后进行电泳观察,若出现长度为1.1k