怎样用葡聚糖凝胶测定多糖分子量,有原理和过程.

怎样用葡聚糖凝胶测定多糖分子量,有原理和过程.

多糖的分子量测定常用的是凝胶滤过法.将充分膨胀好的SephadexG-200、G-150或G-75湿法装柱,用一定离子强度的氯化钠水溶液进行平衡,然后将各种不同的已知分子量的多糖分别相继上柱,同一离子强度的氯化钠水溶液洗脱,分步收集,苯酚-硫酸法监测,分别求得洗脱体积Ve,然后再将兰葡聚糖（MV>200万）上同一条柱,求出柱的空体积Vo,根据Ve/Vo与logM之间存在着线性关系,可绘制标准曲线.最后,将待测样品按上述不变的条件上柱,求得待测多糖的Ve.通过标准曲线上的Ve/Vo,查得待测多糖的分子量对数,便可求出M.
对于黏度大的多糖,可采用黏度法求得.亦有用蒸汽压渗透法（VPO,基本原理是根据理想溶液的拉乌尔定律,参考文献：崔锡红,等.蒸汽压渗透法分析异丁烯的数均分子量.河南化工.2001,1:32.骆传环.蒸气压渗透计测定多糖分子量.现代科学仪器,1994,4:11.）、超速离心法（骆传环,等.香姑多糖的分子量测定.科学技术与工程.2006,6(8):1058~1060）、光散射法（LS,光散射法测定高分子量基于高分子溶液的瑞利散射,垂直偏振光通过溶液产生的不同角度散射光的强度与溶质分子的大小即分子量成正比.参考文献：魏立平,姜雄平.光散射法在医学分子生物学中的应用.国外医学分子生物学分册.2000,22(2):123.）、玻璃纤维纸电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）,SDS能断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂,蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中,与SDS分子按比例结合,形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物,这种复合物由于结合大量的SDS,使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异,由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的,因此在进行电泳时,蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小.当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式：logMW=K-bX,式中：MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量.应用如,将标准相对分子量蛋白质与样品进行SDS-PAGE凝胶电泳,以标准蛋白质的迁移率为纵坐标,lgM为横坐标,绘制相对分子质量曲线.根据样品迁移率得出相对分子质量.）测分子量,黏度法及超滤法估计分子量.利用不同方法测定多糖分子量可以从不同角度对多糖分子量进行确证,同时也是对多糖纯度的考察.在测定过程中要注意标准品的选择,尽量使用与被测多糖结构相似的标准品,因为不同结构的标准品虽然其绝对分子量相同而在一定条件下所表现的分子量会有所不同.
多糖分子量的测定没有一种绝对的方法,其分子量只代表相似链长的平均配比而不是确切的分子大小.往往用不同的方法会得到不同的分子量.摘自：季宇彬 《中药多糖的化学与药理》人民卫生出版社