作业帮BLAST设计引物的问题?
来源：学生作业帮 编辑：作业帮 分类：综合作业 时间：2024/07/13 23:42:32
BLAST设计引物的问题?
原来用Primer5.0设计引物,但是效果一直都不好,怀疑特异性不强,现在改用BLAST设计引物：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/,但是在这一步,
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我不知道如何选择参数,我是做果树的,但是我们实验室有人做病毒,我现在怀疑有DNA污染,我的问题是,如何设置参数,才能达到以下俩个目的：1、对我的基因克隆达到最好的效果,2、避免克隆到其他的DNA,尤其是这个病毒的污染,如果在用blast设计引物有心得的话,请一并告诉,
原来用Primer5.0设计引物,但是效果一直都不好,怀疑特异性不强,现在改用BLAST设计引物：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/,但是在这一步,
,我不知道如何选择参数,我是做果树的,但是我们实验室有人做病毒,我现在怀疑有DNA污染,我的问题是,如何设置参数,才能达到以下俩个目的：1、对我的基因克隆达到最好的效果,2、避免克隆到其他的DNA,尤其是这个病毒的污染,如果在用blast设计引物有心得的话,请一并告诉,
这个参数其实是选定物种,你可以尝试在第一次设计的时候,只添加你做的果树的物种的拉丁名去检索.
获得理想的序列以后,用病毒的基因组去blast,确认你的引物序列在里面没有,或很少有同源序列就好了.
如果确认你的样品中有这个序列,引物用primer设计过没有问题,最好能够查看一下：
1.样品制备的问题,是否能够再次纯化模板DNA,或者是稀释模板,减少样品中的干扰成分
2.选择热启动DNA聚合酶,减少非特异扩增（或者选择商品化的Mix,Mix都经过优化的,扩增能力比普通Taq酶,或者是高保真酶要强）
3.用梯度PCR的方式,摸索最佳的退火温度,减少非特异扩增
4.如果确实有其他外源DNA的污染,最好把水,引物,酶全部都换新的再试,因为一旦出现污染,哪怕只是一点点,也会对结果有很大干扰的.
再问： 谢谢您了，您的回答基本满足了我的问题，我们现在测序结果回来最多的是荧光假单胞杆菌，好几个人做完后，测序结果都是这个的， 对于，你回答的第三点，我有些疑问，我做了梯度PCR，温度从55-65，条带都一样，很多很杂，但是没有什么明显的区别，是不是引物特异性不够强，还是这么回事
再答： 通常出现多的条带，是由于引物特异性的问题带来的，但是如果样品中有污染的话，就不好说了。所以引物设计好后，可以在有可能污染的物种中blast一下，看看什么情况，如果没有同源序列的话，就在自己物种的基因组中blast，看是什么位置引起了非特异结合，考虑更换引物的位置。 但是，如果样品中有污染，基本上梯度PCR就没有什么用了。因为如果条带一样很多，需要看一下，不加引物的对照，或者换一个模板的对照，能给出什么结果。如果不加引物或者其他模板，结果一样，还是赶紧调整体系。
获得理想的序列以后,用病毒的基因组去blast,确认你的引物序列在里面没有,或很少有同源序列就好了.
如果确认你的样品中有这个序列,引物用primer设计过没有问题,最好能够查看一下：
1.样品制备的问题,是否能够再次纯化模板DNA,或者是稀释模板,减少样品中的干扰成分
2.选择热启动DNA聚合酶,减少非特异扩增（或者选择商品化的Mix,Mix都经过优化的,扩增能力比普通Taq酶,或者是高保真酶要强）
3.用梯度PCR的方式,摸索最佳的退火温度,减少非特异扩增
4.如果确实有其他外源DNA的污染,最好把水,引物,酶全部都换新的再试,因为一旦出现污染,哪怕只是一点点,也会对结果有很大干扰的.
再问： 谢谢您了，您的回答基本满足了我的问题，我们现在测序结果回来最多的是荧光假单胞杆菌，好几个人做完后，测序结果都是这个的， 对于，你回答的第三点，我有些疑问，我做了梯度PCR，温度从55-65，条带都一样，很多很杂，但是没有什么明显的区别，是不是引物特异性不够强，还是这么回事
再答： 通常出现多的条带，是由于引物特异性的问题带来的，但是如果样品中有污染的话，就不好说了。所以引物设计好后，可以在有可能污染的物种中blast一下，看看什么情况，如果没有同源序列的话，就在自己物种的基因组中blast，看是什么位置引起了非特异结合，考虑更换引物的位置。 但是，如果样品中有污染，基本上梯度PCR就没有什么用了。因为如果条带一样很多，需要看一下，不加引物的对照，或者换一个模板的对照，能给出什么结果。如果不加引物或者其他模板，结果一样，还是赶紧调整体系。