用氯化钙制备感受态细胞的做转化后一个菌落都张不出的原因 我是按照文献步骤做的呀
来源:学生作业帮 编辑:作业帮 分类:生物作业 时间:2024/10/05 00:48:28
用氯化钙制备感受态细胞的做转化后一个菌落都张不出的原因 我是按照文献步骤做的呀
1、 取大肠杆菌原始菌株(无外源质粒)单菌落接种于5mlLB培养液中,37℃,摇荡过夜;
2、 取1ml过夜培养物接种于100mlLB培养液中,37℃振荡培养3—4小时,待细菌达到对数生长期(OD600为0.5-0.6)即可;
3、 将培养液转移到两只预冷的50ml无菌离心管中,置冰上10分钟,使菌液冷却到0℃ 3000rpm、4℃离10min;
4、 弃上清,每只离心管加入10ml冰冷的0.05%无菌CaC12将菌体重悬,冰浴放置30分钟,3000rpm、4℃离心10min;
5、 每只离心管加入2ml冰冷保存液0.05%的Cacl2+甘油重悬沉淀,将两管混合,按每样200ul分装于无菌1.5ml离心管中;
6、 迅速放置于-80℃保存备用.
1、 取大肠杆菌原始菌株(无外源质粒)单菌落接种于5mlLB培养液中,37℃,摇荡过夜;
2、 取1ml过夜培养物接种于100mlLB培养液中,37℃振荡培养3—4小时,待细菌达到对数生长期(OD600为0.5-0.6)即可;
3、 将培养液转移到两只预冷的50ml无菌离心管中,置冰上10分钟,使菌液冷却到0℃ 3000rpm、4℃离10min;
4、 弃上清,每只离心管加入10ml冰冷的0.05%无菌CaC12将菌体重悬,冰浴放置30分钟,3000rpm、4℃离心10min;
5、 每只离心管加入2ml冰冷保存液0.05%的Cacl2+甘油重悬沉淀,将两管混合,按每样200ul分装于无菌1.5ml离心管中;
6、 迅速放置于-80℃保存备用.
可能性很多.
1、感受态不好.“待细菌达到对数生长期(OD600为0.5-0.6)”,你测OD了吗?其实很麻烦,建议稍微有点混就好用了;感受态细菌在无抗生素培养基上能否生长?
2、菌株与质粒不兼容.
3、转化体系也很关键.DNA宁可少点,多了影响效率.
4、DNA是否正确,至少是环状的.有无做超螺旋质粒的阳性对照?如果你做的是质粒构建的话,转化效率很低,有个对照会很好判断意外.
5、转化过程的操作.热休克、和复苏是否正确?复苏时不能加抗生素?
6、培养基是否正确?
建议做阳性对照(质粒)和阴性对照(没转化的感受态不能生长),有了对照结果就好判断了
1、感受态不好.“待细菌达到对数生长期(OD600为0.5-0.6)”,你测OD了吗?其实很麻烦,建议稍微有点混就好用了;感受态细菌在无抗生素培养基上能否生长?
2、菌株与质粒不兼容.
3、转化体系也很关键.DNA宁可少点,多了影响效率.
4、DNA是否正确,至少是环状的.有无做超螺旋质粒的阳性对照?如果你做的是质粒构建的话,转化效率很低,有个对照会很好判断意外.
5、转化过程的操作.热休克、和复苏是否正确?复苏时不能加抗生素?
6、培养基是否正确?
建议做阳性对照(质粒)和阴性对照(没转化的感受态不能生长),有了对照结果就好判断了
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