作业帮毛细管电泳激光诱导荧光原理是什么?
来源：学生作业帮 编辑：作业帮 分类：生物作业 时间：2024/11/07 23:39:00
毛细管电泳激光诱导荧光原理是什么?
建立了毛细管电泳?激光诱导荧光检测(CE?LIFD)技术测定人血浆中富马酸比索洛尔含量的新方法.选用荧光素异硫氰酸酯（FITC）为衍生化试剂,当缓冲溶液为25 mmol/L Na2B4O7（pH 9.2）、分离电压25 kV、柱温20 ℃、电动进样（10 kV×8 s）、以峰面积内标法定量、于激发波长/发射波长= 488/520 nm柱上检测时,富马酸比索洛尔得到较好分离.在选定的电泳条件下,对其线性范围(20～1000 μg/L)、检出限(10 μg/L)、重现性(日内和日间精密度分别小于4.44%和5.59%)和回收率（96.19％～101.80％）进行了测定.结果表明：迁移时间的重现性＜1.58%；峰面积之比的重现性＜6%.
准确称取富马酸比索洛尔和酒石酸美托洛尔各5 mg,加水溶解,分别定容至50 mL,配制成100 mg/L 标准储备液,4 ℃冰箱放置,备用.
准确称取5 mg FITC溶于5 mL乙腈中,配制成2.5 mmol/L储备液,临用前用乙腈稀释至所需浓度.
2.3 空白血浆的制备
健康人空腹,于肘静脉处取血,放于装有肝素钠抗凝剂的离心管中,30 ℃静置,然后以3000 r/min 离心10 min,取上清液于另一离心管中,－20 ℃冰箱中冷藏备用.
2.4 生物样品前处理
取肝素化的含药血浆1 mL,置10 mL 离心管中,同时加入20 μL 内标溶液,加0.2 g NaCl及50 μL浓氨水,旋涡振荡30 s 后,加入醋酸乙酯3.0 mL.为防止乳化现象,于室温下静置2 min 后,再用快速混匀仪混旋提取1 min,以3000 r/min 离心3 min,移取上层有机层至另一离心管中,40 ℃下N2 流吹干,得富马酸比索洛尔和内标的残留物.
2.5 荧光衍生化反应
在上述残留物中加入0．5 mmol/L FITC 乙腈液400 μL,再加入200 mmol/L Na2HPO4水溶液200 μL和400 μL水,室温,暗处放置过夜.衍生后产物用水稀释至2 mL,上机分离.
2.6 实验方法
将血样进行预处理,以FITC为衍生化试剂,考察影响衍生化的重要因素,并用美托洛尔为内标物,确定富马酸比索洛尔衍生物与其分离的最佳电泳条件.实验前,缓冲液超声脱气10 min,每天开机时分别用0.1 mol/L NaOH、超纯水、缓冲液冲洗毛细管柱3 min,运行5次后更换新的缓冲液,以确保分析结果的重现性.
准确称取富马酸比索洛尔和酒石酸美托洛尔各5 mg,加水溶解,分别定容至50 mL,配制成100 mg/L 标准储备液,4 ℃冰箱放置,备用.
准确称取5 mg FITC溶于5 mL乙腈中,配制成2.5 mmol/L储备液,临用前用乙腈稀释至所需浓度.
2.3 空白血浆的制备
健康人空腹,于肘静脉处取血,放于装有肝素钠抗凝剂的离心管中,30 ℃静置,然后以3000 r/min 离心10 min,取上清液于另一离心管中,－20 ℃冰箱中冷藏备用.
2.4 生物样品前处理
取肝素化的含药血浆1 mL,置10 mL 离心管中,同时加入20 μL 内标溶液,加0.2 g NaCl及50 μL浓氨水,旋涡振荡30 s 后,加入醋酸乙酯3.0 mL.为防止乳化现象,于室温下静置2 min 后,再用快速混匀仪混旋提取1 min,以3000 r/min 离心3 min,移取上层有机层至另一离心管中,40 ℃下N2 流吹干,得富马酸比索洛尔和内标的残留物.
2.5 荧光衍生化反应
在上述残留物中加入0．5 mmol/L FITC 乙腈液400 μL,再加入200 mmol/L Na2HPO4水溶液200 μL和400 μL水,室温,暗处放置过夜.衍生后产物用水稀释至2 mL,上机分离.
2.6 实验方法
将血样进行预处理,以FITC为衍生化试剂,考察影响衍生化的重要因素,并用美托洛尔为内标物,确定富马酸比索洛尔衍生物与其分离的最佳电泳条件.实验前,缓冲液超声脱气10 min,每天开机时分别用0.1 mol/L NaOH、超纯水、缓冲液冲洗毛细管柱3 min,运行5次后更换新的缓冲液,以确保分析结果的重现性.