可溶性表达的蛋白如何纯化?纯化后如何除咪唑?

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：综合作业时间：2024/10/03 08:56:35

1,破细胞,高速离心收上清收集上清（同时平衡好柱子）；
2,既然你是His-tag,用Ni-NTA之类的柱子,两次上柱,buffer平衡；
3,低浓度咪唑（5mM）洗5-10柱体积,以洗去杂蛋白；
4,过梯度咪唑（10-500MM）,用紫外检测仪监测280nm,收下每个峰；
5,用峰液跑SDS-PAGE,看哪个峰的蛋白浓度和纯度最为理想；
6,脱咪唑以及换buffer、脱盐,有两种基本方法：A,透析（经济、简便）；B,用脱盐柱（需要有仪器及柱子,更简便更省时）.
关于您说的蛋白没有活性的问题,我建议您在脱咪唑之前,就用峰液去测活性（如果咪唑不影响活性的检测手段）,一般来讲,咪唑不会对蛋白的活性有太大影响.如果脱咪唑之前就已经没有活性,那就不是脱咪唑的问题,而是要往前追溯问题.比如,有无移码、tag对蛋白性质影响如何、破细胞的方法是否影响蛋白等等.
对可溶性蛋白的表达及纯化,我有多年经验,若有疑问,欢迎继续讨论.
再问：非常感谢，回答的很到位。依目前实验室的条件，透析比较可行，想用去掉咪唑后的洗脱液（磷酸钠和NaCl）或是PBS透析，不知道哪种缓冲液更合适？我做的蛋白活性检测是需要看抑菌活性，而咪唑本身就有抑菌效果，所以必须透析后检测蛋白的活性。我现在怀疑是蛋白本身折叠就是错误的（该蛋白二硫键很多），可能导致它没有活性，这种情况该怎么办？怎么做才能尽量保证蛋白折叠是正确的？
再答：二硫键较多确实有点麻烦，这种情况，我建议您一是确定下his-tag对其是否有影响，您的蛋白对结构要求高，其实用GST标签表达对其活性和结构可能会更好些，您可以考虑下；二是，如果您用的是Ni填料，可以考虑用低pH的方法洗脱，但您用的是钴离子填料，这个我还真没用过，对其性质完全不了解。还有，您如果怀疑其折叠没有得到正确构象，您可以用脱咪唑的蛋白做个圆二色谱法（cd）检测其二级结构是否正确（咪唑要脱的很彻底，否则对CD影响大）。
再问：好复杂，都没做过呢，不过谢谢，很感激！
再答：如果是一个尚未有成熟纯化体系的蛋白，您的纯化工作本身就是一个很有意义的课题。表达、纯化就是这样，找到原因就很简单了，希望您的实验顺利！

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