作业帮用原核载体克隆并表达一种生物中的某个基因(序列已知),这种生物若是一种原核生物,应如何设计实验?
来源：学生作业帮 编辑：作业帮 分类：生物作业 时间：2024/07/06 00:19:46
用原核载体克隆并表达一种生物中的某个基因(序列已知),这种生物若是一种原核生物,应如何设计实验?
若是一种真核生物,又该如何设计实验?
若是一种真核生物,又该如何设计实验?
原核表达是目前最常用的表达系统,一般在大肠杆菌中做,也有在酵母,乳酸菌或者真核细胞里面做.大肠杆菌是工程菌,易操作,不会存在质粒转不进去的情况.因为酵母,乳酸菌等细胞内部一般都存在限制修饰系统,不是所有的工程质粒都能应用,所以必须找对应的质粒和配套的工程菌株.
大肠就不一样,随便搞.克隆质粒非常非常多,一般选实验室有的,或容易得到的.表达载体也很多,pET系列,pGEX系列,pCold系列等；表达菌也很多,一般BL21系列就足够了,当然有特殊要求的可以在试试其他菌.
好了,我说一下我的步骤.
首先不管是真核还是原核的靶基因,只要对表达菌没有太大损伤,都能在原核表达,前几天我表达一个蛋白一直不成功,就有可能是因为这个蛋白是一种原核胞内酶,对细胞有毒性作用.
然后设计引物将序列已知从细菌或者真核细胞细胞PCR扩增出来（当然了,要先提取基因组）,将扩增出来的产物连进克隆载体,转进感受态,培养以扩增拷贝数,这样就可以得到大量的质粒.
然后提取质粒,将目标片段从克隆载体上切下来（内切酶酶切）,然后连进表达载体,转进表达菌.
第三步,诱导表达,将含有质粒的表达菌培养,OD在0.55-0.7之间时,加诱导物（IPTG）,细菌就表达这个蛋白了,培养一段时间后,收集.
第四步,破碎收集的细菌（一般超生破碎）,破碎后的细菌蛋白就释放出来了,然后将蛋白通过不同的纯化方法纯化出来,就得到你的目标蛋白了.
我个人真核原核没啥区别,
有问题我们在讨论.
大肠就不一样,随便搞.克隆质粒非常非常多,一般选实验室有的,或容易得到的.表达载体也很多,pET系列,pGEX系列,pCold系列等；表达菌也很多,一般BL21系列就足够了,当然有特殊要求的可以在试试其他菌.
好了,我说一下我的步骤.
首先不管是真核还是原核的靶基因,只要对表达菌没有太大损伤,都能在原核表达,前几天我表达一个蛋白一直不成功,就有可能是因为这个蛋白是一种原核胞内酶,对细胞有毒性作用.
然后设计引物将序列已知从细菌或者真核细胞细胞PCR扩增出来（当然了,要先提取基因组）,将扩增出来的产物连进克隆载体,转进感受态,培养以扩增拷贝数,这样就可以得到大量的质粒.
然后提取质粒,将目标片段从克隆载体上切下来（内切酶酶切）,然后连进表达载体,转进表达菌.
第三步,诱导表达,将含有质粒的表达菌培养,OD在0.55-0.7之间时,加诱导物（IPTG）,细菌就表达这个蛋白了,培养一段时间后,收集.
第四步,破碎收集的细菌（一般超生破碎）,破碎后的细菌蛋白就释放出来了,然后将蛋白通过不同的纯化方法纯化出来,就得到你的目标蛋白了.
我个人真核原核没啥区别,
有问题我们在讨论.
用原核载体克隆并表达一种生物中的某个基因(序列已知),这种生物若是一种原核生物,应如何设计实验?
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