上游引物和下游引物

因为RT-PCR的模版是单链的RNA,一种引物就够了,而常规PCR的引物是双链DNA,需要上下游引物从两端同时扩增.

显然是选randomprimer更好,其实说明书是有写的啦,原因是RT-PCR逆转录是要得到一个所有的RNA的cDNA库,然后再P出你要的“几个基因”,所以不是每个基因的mRNA都是有polyA的,很

合成的单链在实验时又一个和模板结合的退火过程,在这个过程中会自动形成茎环结构,如果你的茎环结构设计合理的话.我也在类似文献上看到过上游引物含有额外的碱基,上面有说明的,是为了调整Tm值.上游引物不能全

这是针对逆转录pcr而言,所谓的跨外显子就是一个引物（比如上游引物）、出现在两个外显子交界,那么做RT-PCR时,dna由于2个外显子被内含子隔开,引物就不会起作用了

你理解的没错.上下游引物同时用才能特异性扩增中间的那部分片段.

FPrimer:5'-TTGTAAAAAAATTAAATTAA-3'RPrimer:5'-CATATTTTAATTAATATTTC-3'你这个序列AT含量太高,尤其是5'端A有7个连续重复,引物本身很

上游：5ggaattcatgtttagtttgaaaaaaac3下游：5gggttcgaattagacattgccaacatatt3你要的并不是鉴定引物,而是扩增引物根本不用软件

Tm值本来就是人为定的一个预测值,三个Tm值代表的是不同的计算方法,常用的是第三种2*AT+4GC.看退火温度时,酶切位点和保护碱基一般是不考虑在内的,因为pcr扩增时这段序列一般是不跟模板结合的,所

个人推荐使用PrimerPremier5

上游引物：GAATTCacgcgcaagattagg（后面可以继续加几个碱基,用PRIMER5.0看一下,引物设计多少个碱基合适,每个基因序列不同.我用TOYOBO的KODPLUS的话,就一般引物设计

5':CGGAATTCACGCGCAAGATTAGGTGGGG3':CGGGATCCCCTTGGGAAGAAAAAGCAAG引物组成为：保护碱基+酶切位点+目的基因末端序列.由于你要扩增全部这段序列,

一般使用primer5就挺好,不知道你是扩基因还是启动子,基因是否是已知.PCR引物设计原理:PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列.因此,引物的优劣直接关

不能,扩增酶扩增一定长度后会脱落,但你引物的互补链没有扩增,无法呈指数扩增,30个循环后只是扩增30倍根本没产物

不,需要两条,因为随着你PCR的进行,另一条互补链会被引物扩增出来,因此你需要两条引物都加进去.再问：那么我引物设计的时候，是不是以mRNA为模版与以CDNA为模版设计的引物都可以？再答：都可以，别忘

NCBI上面得到的是mRNA序列可以用oligodt反转录,也可以用与mRNA互补的特异引物来反转录再问：恩，特异性引物有一对，上游和下游，老师问我用上游还是下游，望回答具体点再答：反转录当然是下游了

那是显然的,所以在提rna做pcr的时候,如果里面混了基因组dna,那就有可能导致假阳性再问：谢谢，但是这不是我想要的答案。请问做半定量RT-PCR的引物怎么设计？可以设计在基因的非翻译区，然后扩非翻

不用考虑.打分高即可.

[color=red][/color]4.28送菌液去某公司测序,昨天收到的测序报告连上下油的引物都找不到.后来我又做了菌落PCR（设阳性,阴性对照）有目的条带.请问各位是什么原因啊?测序结果上不会有

这个问题很简单,扩增序列应该称为目的基因,目的基因一般都上万bp,从两头开始当然不合适.PCR扩增只能扩增出上下游引物之间的序列,因为只有引物之间的DNA双链是解链状态的.你的问题说明你对基础知识掌握

一般认为Tm-5度.但是要看你的Tm计算方法,不同公司合成的引物得出的Tm都不一样,你可以做个梯度PCR看看最适退火温度,以后就有经验了.