pcr结果出不来,每次都是只有100bp以下的条带,没有其他的条带

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：生物作业时间：2024/07/08 18:21:24

pcr结果出不来,每次都是只有100bp以下的条带,没有其他的条带
不管是扩gapdh,还是目的基因,都是只在100bpmarker下有一个条带,其他地方没有任何条带,扩的gapdh应该在200bp左右,RNA纯度分析每次结果都很好的,260/280都在2.0附近.pcr体系是50ul：10xbuffer 5ul Mgcl2 5ul 2.5的dNTPs 4ul 10umol/l的引物个1ul cDNA 2ul .94度 30秒 58度30秒 72度40秒共40个循环.昨天换了新鲜组织刚扩了一个目的基因一个gapdh,两个都是只有一条100bp下的条带,且目的基因的这个条带比较粗亮.我该从哪里找问题?还有用的各种试剂-20度如果过了半年了,是不是已经过期?

首先试剂应该没有问题,现在连作为marker的基因都扩不好,那么一个是你的引物有问题,另一个就是反转录出问题了.遇到这样的问题应该一步一步的排除.
首先确定反转录没有问题,一般的鉴定办法是扩增marker基因,但是你现在gapdh多不出来,要么你就换一个基因试一试,比如actin,或者你直接用随机引物试一试,看看反转录后的产物是否有模糊成片的电泳条带.
如果没有问题,那就看看是不是引物问题,要么是引物没有设计好,要么就是引物稀释时间有些长了,重新稀释.
再然后就可能是PCR条件的问题,比如我做20ul体系的时候,Mg2+用的是1.2-1.4ul,Mg2+浓度越大,扩增的非保守性越多.再看,退火温度合不合适,是否有些高,做一个温度梯度试验可以解决这一问题.
也不知道你做的是什么生物,PCR程序还可以适当的调整,如果扩增不出来,可以试一试tuckdown的方法
在PCR反应体系使用普通的rTaq（Takara）,如果不行,可以将buffer换成G buffer试一试,不要一上来就用特别保守的酶.
另外,100bp一下的那个条带,基本上可以认为是引物二聚体,说明你的引物合成的有问题呀!

pcr结果出不来,每次都是只有100bp以下的条带,没有其他的条带 PCR只有引物二聚体的条带,没有目的基因条带 PCR结果没有条带,都是弥散的,这是为什么 PCR产物电泳检测结果点样孔很亮,没有目的条带.是什么原因?marker的条带正常. PCR目的条带的问题, 我构建的穿梭载体,连接好后进行双酶切和PCR两个途径的检测,结果酶切没有条带显示,而PCR确有目的条带! PCR跑出的条带与目的条带不同怎么办我做的是分子鉴定真菌,用的是通用引物ITS1和ITS4,pcr扩增后只有marker有条带,其他的都没有是什么原因. PCR中,PCV2的引物扩增后,跑电泳的条带在多少bp? PCR扩增不出来条带的原因? 用takara的酵母菌DNA提取试剂盒提取rDNA,PCR后跑电泳总没结果,出现火星带,没有条带,怎么回事? 提取细菌DNA检测到有条带,PCR后无条带;而基因组DNA检测到无条带的,PCR后却有条带.怎么解释?