连接到T载体的pcr产物再切下来,连接到表达载体上,如何保证转录起始点

.同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法.选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步.NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer,以保证100%的酶活性.NEBuffer的组成及

这个是可以的,只是效率不高

已经得到扩增的目的基因片段和克隆载体→对两者分别进行酶切（选要相同的限制性内切酶对两者进行切割）→酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收→克隆载体和目的基因进行连接（一般选用T4连接酶）→大肠杆菌感受态细胞的制

T载体分两种.一种是末端带有A的典型的T载体,这样的T载体可以与taq酶扩增出来的片段连接,另一种是平末端的T载体,这种T载体末端没有A,它用于以pfu或者是phusion这样的高/超保真酶扩增出来的

原来扩增的时候就有两条带,回收的时候（是凝胶回收吗?）可能因为产物浓度过大,导致两条带没跑开,让你一起切下来了（回收后电泳检测了没?）,所以连接后有两种克隆.至于说为什么会出现两种克隆,要具体问题具体

不管酶切还是PCR,都是间接的结果.要确定克隆的正确,一定要测序的啊.你测个序,问题就迎刃而解了.到底是什么问题也就清楚了.再问：我前些天去遇到一样的问题，酶切鉴定正确，但测序后什么也不是呢再答：所以

那要看你做什么用,如果下一步你要构建载体的话,就需要相应的酶切位点,以便下一步操作.如果不做就没必要了.再问：只是想送去测序...为什么可以直接连接呢？再答：那就没必要加酶切位点了，因为现在的聚合酶一

目的基因和载体比例最好再核对一下,连接时间放久一点试试

用的是T-simple吗?如果不是simple载体,有可能切开的不是你引入的的没切位点,而是载体本身的再问：用的是T-simple啊，发现酶切条带都变大了再答：大了多少？是用的takara的pmd18

M13F(-47)：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACM13R(-48)：AGCGGATAACAATTTCACACAGGA

BestreactionforEcoRIishighslatbuffer,whileHindIIIislowsaltbuffer.ManycompanieswilltellyouHindIIIwoul

当然先筛选,再做个目的基因PCR检测,找出阳性产物,测序对比无误后再转入细胞喽

理论上讲PCR产物可以直接酶切连接反应.但是,以PCR产物酶切的时候没有办法证明双酶切是否成功、彻底（PCR产物会有ployA的存在必须切掉,但是PCR产物和酶切产物大小差别不大）.而以T载体为媒介,

你这个详细的,可以详细成一本书了,我就粗略给你说说哈~先理解个概念,你所说的一个病毒载体是不能进行病毒包装的,病毒包装时还需要多个辅助质粒才行.病毒包装所需要的蛋白等其他关键元件都在辅助质粒上.首先,

一般来说很难同时连基因和载体相连,首先要用相同的限制性内切酶切割基因和载体,使基因和载体产生相同的黏性末端,才可以使基因和载体相连如果要将两个不同的基因同时连接到一个载体上,那就需要用相同的限制性内切

酶切位点消失啦,测个序看看.再问：测序了，说我的链接质粒没有信号再答：重新做吧，多半不对！

目的基因是动物的相关基因片段PCR扩增的吗?你采用mRNA还是DNA啊?是扩增16SrDNA?不然怎么会显示杆菌的片段?BLAST比对如此奇怪?应该不会插入错误16组,估计实验操作的问题,或者使用NC

应为PCR扩增出来的是混合物,酶切回收后才基本是纯的目的片段.载体一般不用PCR扩增,一般是质粒来源,也需要用切口一致的酶消化回收.之后连起来就好了再问：那PCR扩增出来的混合物里除了目的片段还有什么

要是实际应用的话,你做个链接试试就知道了呗或者电泳的时候点一个没切过的做下对照,迁移率会有差别

完全确保的话,第一,做酶切的两个酶要不一样；二你在做完酶切后,用磷酸化酶处理下,纯化后再连接（这一不会降低连接效率,但会确保质粒不自连.按正确方向克隆