荧光定量PCR做标准曲线,普通PCR扩增效果良好,荧光定量PCR标准曲线作图斜率只有1.02,是什么原因?

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：生物作业时间：2024/10/02 17:59:10

荧光定量PCR做标准曲线,普通PCR扩增效果良好,荧光定量PCR标准曲线作图斜率只有1.02,是什么原因?
引物浓度已经从0.6Ul,调整为0.8ul和1.0ul,

先看melt curve,斜率不对可能反应特异性不好,检查是否有非特异产物.如果是特异性问题,调整反应条件或检查引物设计.
标准曲线看斜率之前,先要看线性（几个标准点是否在一条直线上）,关键指标是决定系数R2.如果R2在0.98以下,看斜率是没有意义的.造成标准曲线不直的原因如果是你移液技术不好,你只好重做.另一种可能是标准曲线含有一段线性区间,但在高浓度点发生弯曲.则此时有可能是你的样本含有PCR inhibitor,来源即解决办法如下：
1.可能来自反转录系统.反转录反应的成分不可避免要进入PCR,但其实反转录系统中的某些成分可能抑制PCR反应.如果为了增强信号而使用多过厂商建议分量的cDNA,则可能遇到此种问题.
2.可能来自RNA样本带有的杂质.这个可以通过260/280,260/230吸收峰比值来检查.260/280需要达到1.8以上,最好在2左右.如果样本不纯,可以考虑优化抽提步骤.
3.如果以上两个问题不存在或无法解决,就只有根据曲线的线性区间,选择可以得到线性扩增的模板用量来实验.这里面的原理是PCR inhibitor经过稀释以后作用可以减低至可以忽略.
如果标准曲线R2接近1,线性非常好,产物也特异性强,但扩增效率就是很糟,找厂商谈试剂质量问题吧.

荧光定量PCR做标准曲线,普通PCR扩增效果良好,荧光定量PCR标准曲线作图斜率只有1.02,是什么原因? 我做荧光定量PCR标准曲线时,斜率只有-1.25,扩增效率E很高.为什么呢? 荧光定量PCR熔解曲线怎么判断实时荧光定量PCR标准曲线是否准确荧光定量pcr标准曲线中的扩增效率太高怎么办荧光定量PCR扩增曲线基线过高什么原因请问做实时荧光定量PCR实验时,为什么做标准曲线? 请问做荧光定量PCR时每次都需要做标准曲线吗? 荧光定量PCR绝对定量时的标准曲线优劣的判断指标有哪些呢? 荧光定量pcr做荧光定量pcr的绝对定量时为什么要构建标准质粒,利用质粒构建标准曲线,为什么不直接用DNA模板构建标准曲荧光定量PCR 标准曲线的制作是不是可以软件自动生成的! 荧光定量PCR RT-PCR