作业帮PCR产物直接测序的原理
来源：学生作业帮 编辑：作业帮 分类：生物作业 时间：2024/11/06 03:46:41
PCR产物直接测序的原理
原理：
是来至于双脱氧链终止法——现在应用最多的核酸测序技术,由Sanger等1977年提出：
模板经过测序PCR反应后形成3'末端带有荧光标记（早期用同位素标记）的相差一个碱基的不同长度的产物,再根据每段DNA产物的电泳速度来检测整段DNA的序列.
以上——手打——希望对你有帮助
优点：
一是操作易于标准化与自动化,因为它是一个单一的酶的反应过程,不依赖于生物体；
二是通过一次测序反应就能确定样品中某个等位基因的顺序,而PCR产物克隆后测序时,样品顺序要在测定了数个克隆片段之后才能确定.因为只有这样,才能区别突变是基因组本来就有的,还是由于Tag聚合酶在PCR过程中错误掺入核苷酸引起的.
再问： 那麻烦了，我还想知道一下，为什么测序结果中前后100bp的序列不可信，即为什么测序信号不好？这是怎么造成呢？
再答： PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。 通常我们很容易辨别PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿色峰），这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们用T载体克隆PCR产物就是根据该原理的。在最后一个碱基A后，信号会迅速减弱。 因此我们要根据序列正确判断出PCR产物的末端序列，在此序列以外就不是我们所要的序列了。 在序列的起始端有时会有一些N值。该种情况主要是有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器将无法正确判断出为何碱基。有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。 还有，提供的PCR引物用于测序时，有时会产生引物二聚体，对测序的起始区造成干扰，在序列的3’端容易产生N值。
是来至于双脱氧链终止法——现在应用最多的核酸测序技术,由Sanger等1977年提出：
模板经过测序PCR反应后形成3'末端带有荧光标记（早期用同位素标记）的相差一个碱基的不同长度的产物,再根据每段DNA产物的电泳速度来检测整段DNA的序列.
以上——手打——希望对你有帮助
优点：
一是操作易于标准化与自动化,因为它是一个单一的酶的反应过程,不依赖于生物体；
二是通过一次测序反应就能确定样品中某个等位基因的顺序,而PCR产物克隆后测序时,样品顺序要在测定了数个克隆片段之后才能确定.因为只有这样,才能区别突变是基因组本来就有的,还是由于Tag聚合酶在PCR过程中错误掺入核苷酸引起的.
再问： 那麻烦了，我还想知道一下，为什么测序结果中前后100bp的序列不可信，即为什么测序信号不好？这是怎么造成呢？
再答： PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。 通常我们很容易辨别PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿色峰），这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们用T载体克隆PCR产物就是根据该原理的。在最后一个碱基A后，信号会迅速减弱。 因此我们要根据序列正确判断出PCR产物的末端序列，在此序列以外就不是我们所要的序列了。 在序列的起始端有时会有一些N值。该种情况主要是有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器将无法正确判断出为何碱基。有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。 还有，提供的PCR引物用于测序时，有时会产生引物二聚体，对测序的起始区造成干扰，在序列的3’端容易产生N值。
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